определение
Ферменты - это белки, вырабатываемые в растительных и животных клетках, которые действуют как катализаторы, ускоряя биологические реакции без изменения.
Ферменты работают путем объединения с конкретным веществом, чтобы превратить его в другое вещество; классические примеры приводятся пищеварительными ферментами, присутствующими в слюне, желудке, поджелудочной железе и тонкой кишке, которые выполняют важную функцию в пищеварении и помогают расщеплять пищу на основные составляющие, которые затем могут поглощаться и использоваться организмом. перерабатывается другими ферментами или выбрасывается в отходы.
Каждый фермент играет определенную роль: например, тот, который расщепляет жиры, не влияет на белки или углеводы. Ферменты необходимы для благополучия организма. Дефицит, даже одного фермента, может вызвать серьезные расстройства. Довольно известным примером является фенилкетонурия (ФКУ), заболевание, характеризующееся неспособностью метаболизировать незаменимую аминокислоту, фенилаланин, накопление которой может вызвать физические уродства и психические заболевания.
Биохимический анализ
Ферменты представляют собой особые белки, которые характеризуются тем, что являются биологическими катализаторами, то есть они способны уменьшать энергию активации (Eatt) реакции, изменяя ее путь, чтобы кинетически медленный процесс появлялся быстрее.
Ферменты увеличивают кинетику термодинамически возможных реакций и, в отличие от катализаторов, более или менее специфичны: поэтому они обладают субстратной специфичностью.
Фермент не участвует в стехиометрии реакции: для этого важно, чтобы конечный каталитический сайт был идентичен исходному.
В каталитическом действии почти всегда есть медленная фаза, которая определяет скорость процесса.
Когда мы говорим об энзимах, неправильно говорить о равновесных реакциях, мы говорим вместо устойчивого состояния (состояния, в котором определенный метаболит образуется и потребляется непрерывно, поддерживая его концентрацию практически постоянной во времени). Продукт реакции, катализируемый ферментом, обычно сам является реагентом для последующей реакции, катализируемой другим ферментом и так далее.
Ферментативные процессы обычно состоят из последовательностей реакций.
Таким образом, общая реакция, катализируемая ферментом (Е), может быть схематизирована:
Универсальный фермент (E) объединяется с субстратом (S) с образованием аддукта (ES) с константой скорости K1; он может снова диссоциировать в E + S с константой скорости K2, или (если «живет» достаточно долго) он может перейти к формированию P с константой скорости K3.
Продукт (P), в свою очередь, может рекомбинировать с ферментом и преобразовывать аддукт с константой скорости K4.
Когда фермент и субстрат смешаны, существует доля времени, в течение которого встреча между двумя видами еще не произошла: то есть существует чрезвычайно короткий интервал времени (который зависит от реакции), в котором фермент и субстрат еще не встречались; после этого периода энзим и субстрат вступают в контакт в увеличивающихся количествах и образуется аддукт ES. Впоследствии фермент воздействует на субстрат и продукт высвобождается. Затем можно сказать, что существует начальный интервал времени, в течение которого концентрация аддукта ES не определима; после этого периода предполагается, что установившееся состояние устанавливается, т.е. скорость процессов, ведущих к аддукту, равна скорости процессов, ведущих к разрушению аддукта.
Константа Михаэлиса-Ментена (КМ) является константой равновесия (относится к первому равновесию, описанному выше); с хорошим приближением можно сказать (поскольку следует также учитывать K3), что KM представляется отношением кинетических констант K2 и K1 (что относится к разрушению и образованию ES аддукта в первом равновесии, описанном выше).
Через константу Михаэлиса-Ментена мы имеем указание на сродство между ферментом и субстратом: если КМ мало, то существует высокое сродство между ферментом и субстратом, поэтому аддукт ES является стабильным.
Ферменты подлежат регулированию (или модуляции).
В прошлом говорили прежде всего об отрицательной модуляции, то есть об ингибировании каталитических способностей фермента, но можно также иметь положительную модуляцию, то есть существуют виды, способные усиливать каталитические способности фермента.
Существует 4 типа запретов (полученных из приближений, сделанных на модели для согласования экспериментальных данных с математическими уравнениями):
- конкурентное торможение
- неконкурентное торможение
- Неконкурентное торможение
- конкурентное торможение
Говорят о конкурентном торможении, когда молекула (ингибитор) способна конкурировать с субстратом. По структурному сходству ингибитор может реагировать вместо субстрата; отсюда и термин «конкурентное торможение». Вероятность того, что фермент связывается с ингибитором или субстратом, зависит от концентрации обоих и их сродства с ферментом; скорость реакции зависит от этих факторов.
Чтобы получить ту же скорость реакции, которая произошла бы без присутствия ингибитора, необходимо иметь более высокую концентрацию субстрата.
Экспериментально показано, что в присутствии ингибитора константа Михаэлиса-Ментена увеличивается.
Что касается неконкурентного ингибирования, то взаимодействие между молекулой, которая должна работать как модулятор (положительный или отрицательный ингибитор), и ферментом происходит в сайте, который отличается от сайта, в котором взаимодействие между ферментом и субстратом; поэтому мы говорим об аллостерической модуляции (от греческого allosteros → другой сайт).
Если ингибитор связывается с ферментом, он может вызывать изменение структуры фермента и, следовательно, может снижать эффективность, с которой субстрат связывается с ферментом.
В этом типе процесса постоянная Михаэлиса-Ментена остается постоянной, так как это значение зависит от равновесий между ферментом и субстратом и эти равновесия даже в присутствии ингибитора не изменяются.
Феномен некомпетентного торможения встречается редко; Типичным некомпетентным ингибитором является вещество, которое обратимо связывается с аддуктом ES, вызывая ESI:
Ингибирование избытка субстрата иногда может быть некомпетентного типа, поскольку это происходит, когда вторая молекула субстрата связывается с комплексом ES, давая начало комплексу ESS.
С другой стороны, конкурентный ингибитор может связываться только с аддуктом субстратного фермента, как в предыдущем случае: связывание субстрата со свободным ферментом вызывает конформационную модификацию, которая делает сайт доступным для ингибитора.
Константа Михаэлиса Ментена уменьшается с увеличением концентрации ингибитора: по-видимому, поэтому увеличивается сродство фермента к субстрату.
Сериновые протеазы
Они представляют собой семейство ферментов, к которым относятся химотрипсин и трипсин.
Химотрипсин является протеолитическим и гидролитическим ферментом, который направляет гидрофобные и ароматические аминокислоты справа.
Продукт гена, который кодирует химотрипсин, не активен (он активируется командой); неактивная форма химотрипсина представлена полипептидной цепью из 245 аминокислот. Химотрипсин имеет глобулярную форму благодаря пяти дисульфидным мостикам и другим незначительным взаимодействиям (электростатическим, ван-дер-ваальсовым, водородным связям и т. Д.).
Химотрипсин вырабатывается химатическими клетками поджелудочной железы, где он содержится в специальных мембранах и выводится через проток поджелудочной железы в кишечник во время переваривания пищи: химотрипсин на самом деле является пищеварительным ферментом. Белки и питательные вещества, которые мы принимаем в рационе, подвергаются перевариванию, чтобы быть уменьшенными до более мелких цепей и поглощаться и преобразовываться в энергию (например, амилазы и протеазы расщепляют питательные вещества на глюкозу и аминокислоты, которые достигают клеток, через кровеносные сосуды они достигают воротной вены, и оттуда они передаются в печень, где они подвергаются дальнейшему лечению).
Ферменты образуются в неактивной форме и активируются только тогда, когда они достигают «места, где они должны работать»; когда их действие закончено, они деактивируются. После дезактивации фермент не может быть реактивирован: для дополнительного каталитического действия он должен быть заменен другой молекулой фермента. Если бы химитрипсина уже вырабатывалась в активной форме в поджелудочной железе, она бы напала на последнюю: панкреатит - это патология, вызванная пищеварительными ферментами, которые уже активированы в поджелудочной железе (а не в необходимых местах); некоторые из них, если их вовремя не лечить, приводят к смерти.
В химотрипсине и во всех сериновых протеазах каталитическое действие обусловлено наличием алколатного аниона (-CH2O-) в боковой цепи серина.
Сериновые протеазы носят это название именно потому, что их каталитическое действие обусловлено серином.
Как только весь фермент выполнил свое действие, прежде чем он снова сможет снова воздействовать на субстрат, его необходимо восстановить водой; «Освобождение» серина водой является самой медленной стадией процесса, и именно эта фаза определяет скорость катализа.
Каталитическое действие происходит в две фазы:
- образование анионов с каталитическими свойствами (алколатный анион) и последующее нуклеофильное воздействие на карбонильный углерод (C = O) с разрывом пептидной связи и образованием сложного эфира;
- атака воды с восстановлением катализатора (способная, таким образом, вновь осуществлять его каталитическое действие).
Различные ферменты, принадлежащие к семейству сериновых протеаз, могут состоять из разных аминокислот, но, в целом, каталитический сайт представлен алколатным анионом боковой цепи серина.
Подсемейство сериновых протеаз - это семейство ферментов, участвующих в коагуляции (которое состоит в превращении белка из его неактивной формы в другую активную форму). Эти ферменты обеспечивают максимально эффективную коагуляцию и ее ограничение по времени и пространству (коагуляция должна происходить быстро и должна происходить только вблизи поврежденного участка). Ферменты, участвующие в коагуляции, активируются в каскаде (из-за активации одного фермента получаются миллиарды ферментов: каждый активированный фермент, в свою очередь, активирует многие другие ферменты).
Тромбоз - это заболевание, вызванное неправильным функционированием ферментов коагуляции: оно вызвано активацией, без необходимости (из-за отсутствия повреждений), ферментов, используемых при коагуляции.
Существуют модулирующие ферменты (регуляторы) и ингибирующие ферменты для других ферментов: взаимодействуя с последними, они регулируют или ингибируют свою активность; даже продукт фермента может быть ингибитором фермента. Есть также ферменты, которые работают больше, чем больше субстрата.
Лизоцим
Луиджи Пастер обнаружил, случайно чихая на чашке Петри, что в слизи есть фермент, способный убивать бактерии: лизоцим ; от греческого: liso = который режет; Зимо = фермент.
Лизоцим способен разрушать клеточную стенку бактерий. Бактерии и, как правило, одноклеточные организмы нуждаются в механически устойчивых структурах, которые ограничивают их форму; внутри бактерий очень высокое осмотическое давление, поэтому они притягивают воду. Плазматическая мембрана взорвалась бы, если бы не было клеточной стенки, которая препятствовала бы проникновению воды и ограничивала объем бактерии.
Клеточная стенка состоит из полисахаридной цепи, в которой чередуются молекулы N-ацетилглюкозамина (NAG) и молекулы N-ацетилмураминовой кислоты (NAM); связь между NAG и NAM разрушается в результате гидролиза. Карбоксильная группа NAM в клеточной стенке участвует в пептидной связи с аминокислотой.
Между различными цепями образуются мостики, состоящие из псевдопептидных связей: разветвление происходит из-за молекулы лизина; структура в целом очень разветвленная, что придает ей высокую стабильность.
Лизоцим является антибиотиком (он убивает бактерии): он действует, создавая трещину в бактериальной стенке; когда эта структура разрушена (что является механически устойчивым), бактерия притягивает воду, пока не лопнет. Лизоцим способен разорвать глюкозидную связь b-1, 4 между NAM и NAG.
Каталитический сайт лизоцима представлен бороздкой, проходящей вдоль фермента, в который вставлена полисахаридная цепь: шесть глюкозидных колец цепочки находят свое место в бороздке.
В позиции три канавки имеется узкое место: в этой позиции может быть размещен только один NAG, потому что NAM, которое больше, не может войти. Фактический каталитический сайт находится между положениями четыре и пять: если NAG находится в положении три, разрез будет происходить между NAM и NAG (а не наоборот); следовательно, сокращение является определенным.
Оптимальный рН для функционирования лизоцима составляет пять. В каталитическом сайте фермента, который находится между положениями 4-5, имеются боковые цепи аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
Степень гомологии : измеряет отношения (то есть сходство) между структурами белка.
Существует строгая связь между лизоцимом и лактозосинтетазой.
Лактозосинтаза синтезирует лактозу (которая является основным сахаром в молоке): лактоза представляет собой галактозилглюкозид, в котором между галактозой и глюкозой существует β-1, 4-глюкозидная связь.
Таким образом, лактозосинтетаза катализирует реакцию, противоположную той, которая катализируется лизоцимом (который вместо этого разрушает глюкозидную связь β-1, 4)
Лактозосинтаза представляет собой димер, то есть состоит из двух белковых цепей, одна из которых обладает каталитическими свойствами и сравнима с лизоцимом, а другая является регуляторной субъединицей.
Во время беременности гликопротеины синтезируются из клеток молочной железы под действием галатозилтрансферазы (она имеет 40% гомологию последовательности с лизоцимом): этот фермент способен переносить галактозильную группу из высокоэнергетической структуры к структуре гликопротеина. Во время беременности индуцируется экспрессия гена, кодирующего галактоз-трансферазу (есть также экспрессия других генов, которые также дают другие продукты): увеличивается размер груди, потому что молочная железа активируется (ранее не активен), который должен производить молоко. Во время родов вырабатывается α-лакталальбумин, который является регуляторным белком: он способен регулировать каталитическую способность галактозилтрансферазы (благодаря распознаванию субстрата). Галактозилтрансфераза, модифицированная α-лакталальбумином, способна переносить галактозил на молекулу глюкозы: образует β-1, 4-гликозидную связь и дает лактозу (лактозосинтетазу).
Таким образом, галактозтрансфераза подготавливает молочную железу до родов и производит молоко после родов.
Для получения гликопротеинов галактозилтрансфераза связывается с галактозилом и NAG; во время рождения лактальный альбумин связывается с галактозилтрансферазой, заставляя последнюю распознавать глюкозу, а не NAG, чтобы давать лактозу.
